中國學者Science最新發文:首次在個體水平上發現單堿基編輯系統存在脫靶效應

【字體: 時間:2019年03月01日 來源:生物通

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  研究人員首次在體內利用全基因組測序技術全面分析和比較了三種單堿基編輯系統在基因組水平上的脫靶效應。

  

人類遺傳疾病和農作物農藝性狀很多情況下是由基因組中的單個或少數核苷酸的突變引起的。因此,基因組中關鍵核苷酸變異的鑒定與定向修正是人類遺傳疾病治療及動植物育種的重要方向。

基因組編輯工具單堿基編輯器的開發,為定向編輯和修正基因組中的關鍵核苷酸變異提供了重要工具,展現了其在遺傳疾病治療與動植物新品種培育等方面潛在的重大應用價值。

來自中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組發表了題為“Cytosine, But not Adenine, Base Editors Induce Genome-wide Off-target Mutations in Rice”的文章,首次在體內利用全基因組測序技術全面分析和比較了三種單堿基編輯系統在基因組水平上的脫靶效應。

這一研究成果公布在今日(3月1日)Science雜志上,文章一作為靳帥、宗媛以及高強,高彩霞研究員為通訊作者。

單堿基編輯器主要分為兩類,胞嘧啶單堿基編輯器(CBE)與腺嘌呤單堿基編輯器(ABE),分別由胞嘧啶脫氨酶或改造的腺嘌呤脫氨酶與nCas9蛋白融合而來,對應地可在基因組中的靶向位點實現C>T或A>G的堿基編輯。目前,CBE與ABE已在多個物種中得到了廣泛應用。

然而,對它們脫靶效應的檢測還很不充分,數據主要來源于體外實驗研究或者對利用生物信息學軟件預測的有限的靶序列相似位點的檢測,CBE與ABE在體內全基因組范圍的脫靶效應還未得到評估。

在這篇文章中,研究人員在植物中對BE3(基于融合rAPOBEC1胞嘧啶脫氨酶的CBE系統),HF1-BE3(高保真版本BE3)與ABE單堿基編輯系統的特異性進行了全基因組水平評估,首次在體內利用全基因組測序技術全面分析和比較了這三種單堿基編輯系統在基因組水平上的脫靶效應。

這項研究對經過不同單堿基編輯系統轉化的56棵T0代水稻植株與21株對照植株進行全基因組測序。進一步序列統計分析發現,經過單堿基編輯系統處理后,基因組內的插入或刪除(indels)突變的數量與對照組相比沒有顯著變化,但是BE3與HF1-BE3,無論是在有無sgRNA的情況下,均可在水稻基因組中造成大量的單核苷酸變異(SNVs),且大部分為C>T類型的堿基突變。與經過農桿菌轉化但不含任何堿基編輯系統的對照植株相比,BE3系統和HF1-BE3系統處理的植株在基因組范圍內的C>T SNVs分別增加了94.5%和231.9%,大約額外產生了98個C>T SNVs和242個C>T SNVs。

(A)實驗流程與設計。(B)比較BE3、HF1-BE3和ABE系統在全基因組范圍內產生的C>T SNVs的個數。(C)BE3、HF1-BE3和ABE系統在基因組內各個功能區域內C>T SNVs占總C>T SNVs的比例。(D)比較BE3、HF1-BE3和ABE系統在高轉錄區內C>T SNVs占總C>T SNVs的比例。

重要的是,與Cas-OFFinder軟件預測結果比較發現,這些額外增加的C>T SNVs絕大多數并不在現有軟件可以預測到的脫靶位點。此外,這些C>T變異在染色體間均勻分布,但呈現出在轉錄活躍區富集的趨勢。這些區域傾向于釋放單鏈DNA為胞嘧啶脫氨酶提供合適的底物。

研究還發現,與CBE系統相反,ABE系統表現出非常高的特異性。ABE處理的植株與對照植株在全基因組范圍內的SNVs數量基本一致。

這項研究表明現有BE3和HF1-BE3系統,而非ABE系統,可在植物體內造成難以預測的脫靶突變,因此,需要進一步優化提高其特異性。該工作創新性地利用相似遺傳背景的克隆植物及全基因組重測序解決了以前大量異質細胞序列分析的復雜性。

原文標題:

Cytosine, But not Adenine, Base Editors Induce Genome-wide Off-target Mutations in Rice




 
 

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