楊輝課題組再發一篇《Nature》:DNA堿基編輯誘導大量靶外RNA突變

【字體: 時間:2019年06月12日 來源:生物通

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  6月10日《Nature》雜志報道了中國科學院神經科學研究所楊輝課題組與中國科學院計算生物學研究所和四川大學合作完成的一項研究,證實了DNA堿基編輯器會造成數以萬計個非靶向RNA單核苷酸變異(SNVs),這些非靶向SNVs可通過在脫氨酶中引入點突變來加以消除。

  

6月10日《Nature》雜志報道了中國科學院神經科學研究所楊輝課題組與中國科學院計算生物學研究所和四川大學合作完成的一項研究,證實了DNA堿基編輯器會造成數以萬計個非靶向RNA單核苷酸變異(SNVs),這些非靶向SNVs可通過在脫氨酶中引入點突變來加以消除。

這項研究揭示了DNA堿基編輯的一個潛藏風險,還通過工程脫氨酶提供了一個解決問題的方法。

今年,美國麻省總醫院的Keith Joung團隊和哈佛大學David Liu團隊分別在《Nature》和《Science Advances》雜志報道了DNA單堿基編輯器存在大量RNA脫靶,通過突變版本的BE3和ABE可以部分降低RNA的非靶向編輯。

DNA堿基編輯能夠在不產生任何雙鏈斷裂(DSBs)的情況下對基因組DNA進行直接點突變校正,但潛在的脫靶效應限制了它的應用。腺相關病毒(AAV)是最常見的DNA編輯基因治療呈遞系統。由于這些病毒能夠長期維持體內基因表達,因此DNA堿基編輯誘導的潛在RNA靶外效應對其臨床應用具有重要意義。

之前的幾項研究已經評估過DNA堿基編輯的基因組DNA非靶向突變。同時,研究表明與常用DNA堿基編輯器整合的脫氨酶經常表現出RNA結合活性。例如,在胞嘧啶堿基編輯(CBEs)中使用的胞嘧啶脫氨酶APOBEC1被發現可以打靶DNA和RNA,在腺嘌呤堿基編輯(ABEs)中使用的腺嘌呤脫氨酶TadA被發現會誘導RNA上位點特異性肌苷形成。然而,任何由DNA堿基編輯器引起的潛在RNA突變都沒有被很好地評估。

為了在RNA水平上評價DNA堿基編輯的脫靶效應,研究人員計算了CBE或ABE處理細胞中每一個被復制的靶外RNA SNVs,并探討了通過DNA堿基編輯的工程脫氨酶消除靶外RNA SNVs的可能性。

他們將一種類型的CBEs,BE3(APOBEC1 -nCas9-UGI),或一種類型的ABEs,ABE7.10(TadA -TadA*-nCas9),連同GFP和/或無向導RNA(sgRNA)一起轉染到HEK293T培養細胞中。在這些HEK293T細胞中,通過BE3和ABE7.10驗證了DNA編輯的高靶向效率后,他們對這些樣品進行了平均深度為125X的RNA測序,并定量評估了每個復制中的RNA SNVs。

CBE或ABE處理細胞的每次復制都進行靶向編輯效率評估以確保有效編輯,然后將CBE和ABE處理組的非靶向RNA SNVs數量與GFP對照組進行比較。結果發現在DNA堿基編輯處理的細胞中,RNA SNVs的數量顯著增加。

此外,研究人員發現,BE3或ABE7.10處理細胞的突變偏向分別與APOBEC1或TadA的相同,表明靶外效應是由DNA堿基編輯的過度表達引起的。他們還鑒定了這些非靶向RNA SNVs的CBE和ABE特異性基序和遺傳區域。

為了消除堿基編輯的RNA非靶向活性,課題組研究了在APOBEC1或TadA上引入點突變的效果。三個高保真變體BE3W90Y+R126E、BE3(hA3AR128A)和BE3(hA3AY130F),將RNA靶外SNVs降低到了基礎水平。同樣,ABE變體ABE7.10F148A也顯示出了靶外效應的完全消除。

本研究通過在脫氨酶中引入點突變,獲得了CBEs和ABEs的更高保真變體,并提出了一種利用合理工程提高基礎編輯特異性的方法。

楊輝,1985年生,2003-2007年就讀于上海交通大學生命科學學院,獲生物技術學士學位。2007-2012年就讀于中科院上海分院生化細胞所李勁松研究組,獲發育生物學博士學位。2012-2013年在麻省理工Whitehead 研究所 Rudolf Jaenisch 研究組從事博士后研究工作。2014年起任中國科學院上海生命科學研究院神經科學研究所研究員,靈長類疾病模型研究組組長。2010年以來發表了近30篇SCI論文,其中包括以第一作者或通訊作者身份發表的3篇《Cell》、2篇《Nature》和1篇《Science》。

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原文檢索:Zhou, C., Sun, Y.,  Yan, R., Liu, Y.,  Zuo, E.,  Gu, C., Han, L., Wei, Y., Hu, X.,  Zeng, R., Li, Y.*, Zhou, H.*, Guo, F.*, Yang, H. *(2019)Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature

(生物通:伍松)

 

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